基于CRISPR/Cas9敲除阐明AtMST1通过H2S合成调控拟南芥耐盐性

doi:10.7525/j.issn.1673-5102.2026.02.006

摘要/Abstract

摘要：

硫化氢（hydrogen sulfide，H₂S）是植物体内重要的气体信号分子，其生物合成依赖多种内源生成酶。3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，MST）在动物系统中已被证实能够生成H₂S，而拟南芥（Arabidopsis thaliana）MST1也被报道具有类似的酶活性。为在植物体内进一步验证AtMST1蛋白的H₂S生成功能，并探究其在盐胁迫响应中的作用，本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥AtMST1基因进行定向编辑。通过设计4个靶位点并构建基因编辑载体，经农杆菌（Agrobacterium）转化后，成功获得atmst1纯合突变体。基因型分析表明，突变体在靶位点插入单个T碱基，导致移码突变及蛋白质翻译提前终止。生理检测结果显示，与野生型相比，atmst1突变体的H₂S荧光探针信号强度、H₂S含量及产率均显著降低。在盐胁迫处理下，atmst1植株表现出明显的盐敏感表型，且幼苗根中积累更多的活性氧。综上，本研究成功构建了AtMST1蛋白功能缺失突变体，从遗传学层面证实AtMST1蛋白在植物内源H₂S合成中的关键作用，并揭示其通过调节H₂S水平正调控拟南芥耐盐性的生理功能。

关键词: AtMST1基因, CRISPR/Cas9基因编辑技术, 硫化氢, 拟南芥, 盐胁迫

Abstract:

Hydrogen sulfide（H₂S） is an important gaseous signaling molecule in plants， and its biosynthesis relies on various endogenous enzymes. The enzyme 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase（MST） has been established as an H₂S generator in animal systems， and a similar enzymatic activity has been reported for Arabidopsis MST1. To further validate the H₂S-producing function of AtMST1 in plants and explore its role in salt stress response， CRISPR/Cas9-mediated gene editing to target the AtMST1 gene was employed in Arabidopsis thaliana. By designing four target sites and constructing the gene editing vector， homozygous atmst1 mutants following Agrobacterium-mediated transformation were successfully obtained. Genotyping analysis revealed that the mutant carried a single T-nucleotide insertion at the target site， resulting in a frameshift mutation and premature termination of translation. Compared with the wild type， the atmst1 mutant showed a significant reduction in the intensity of H₂S-specific fluorescent signals， as well as in both H₂S content and production rate. Salt stress treatment resulted in a clear salt-sensitive phenotype and greater reactive oxygen species accumulation in the roots of atmst1 seedlings. In summary， this study successfully created an AtMST1 loss-of-function mutant， providing genetic evidence for its crucial role in endogenous H₂S synthesis in plants and revealing its physiological function in positively regulating salt tolerance in Arabidopsis by modulating H₂S levels.

Key words: AtMST1 gene, CRISPR/Cas9 gene-editing technology, hydrogen sulfide, Arabidopsis thaliana, salt stress

中图分类号:

Q789

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引物名称 Primer name	引物编号 Primer ID	引物序列5′→3′ Primer sequence	用途 Purpose
AtMST1-gRNA1-F1	pp2043	ATTGGAAGAGAAGGAGTAATCAGT	gRNA1靶点扩增
AtMST1-gRNA1-R1	pp2044	AAACACTGATTACTCCTTCTCTTC	gRNA1靶点扩增
AtMST1-gRNA2-F2	pp2045	ATTGGTTACTCCACATCATCCGTA	gRNA2靶点扩增
AtMST1-gRNA2-R2	pp2046	AAACTACGGATGATGTGGAGTAAC	gRNA2靶点扩增
AtMST1-gRNA3-F3	pp2047	ATTGAAATCCGATCCAAGAATATC	gRNA3靶点扩增
AtMST1-gRNA3-R3	pp2048	AAACGATATTCTTGGATCGGATTT	gRNA3靶点扩增
AtMST1-gRNA4-F4	pp2049	ATTGGCCACATATGTTGCCCACTG	gRNA4靶点扩增
AtMST1-gRNA4-R4	pp2050	AAACCAGTGGGCAACATATGTGGC	gRNA4靶点扩增
AtMST1-F	pp2247	ATGGCCTCGACCCTTTTCTC	AtMST1阳性植株编辑位点鉴定
AtMST1-R	pp2250	GACCTCCATCGAGCACCCA	AtMST1阳性植株编辑位点鉴定
CAS9-F	pp2060	GCCTGTTCGGAAACCTGAT	Cas9鉴定
CAS9-R	pp2061	GTAGCCGTTCTTGCTCTGG	Cas9鉴定
pKI1.1R-F	pp1729	TGGGAAAGAACAATAGTAT	载体引物，阳性克隆的鉴定

克隆类型 Clone type	数量 Number	占比 Percentage/%
总计	42	100
携带T插入的突变克隆	21	50
携带A插入的突变克隆	8	19
野生型序列克隆	13	31

基于CRISPR/Cas9敲除阐明AtMST1通过H₂S合成调控拟南芥耐盐性

The Role of AtMST1 in Regulating Salt Tolerance via H₂S Synthesis in Arabidopsis Revealed by CRISPR/Cas9 Knockout

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