小黑杨转录因子PsnbZIP1应答盐胁迫功能分析

doi:10.7525/j.issn.1673-5102.2023.02.014

摘要/Abstract

摘要：

为揭示小黑杨（Populus simonii × P. nigra）在面对非生物胁迫时，转录因子PsnbZIP1在植物体内发挥的功能，以小黑杨为试验材料，克隆得到PsnbZIP1的ORF区序列长为432 bp，并初步分析PsnbZIP1盐胁迫下的分子机制。采用q-PCR分析PsnbZIP1在150 mmol·L^-1 NaCl处理小黑杨组培苗时的表达模式，发现该基因的表达量快速上升；通过生物信息学分析预测PsnbZIP1转录因子为无跨膜结构且具有信号肽的亲水性不稳定蛋白；用农杆菌（Agrobacterium）介导的烟草（Nicotiana）瞬时表达观察该基因的亚细胞定位情况，结果表明该基因为核定位蛋白；用酵母单杂交实验证明该基因编码的蛋白在酵母体内不具有转录激活功能。对PsnbZIP1基因的启动子序列进行分析，结果表明该启动子包含了生长素应答、脱落酸应答元件、光应答元件以及种子特异性调控的顺式作用调控元件，该基因可能在植物的生长发育与响应胁迫过程中发挥了重要作用；启动子还包括参与干旱诱导的MYB结合位点和MYBHv1结合位点，表明该基因有可能与一些干旱诱导相关MYB基因相互作用。

关键词: 小黑杨, bZIP转录因子, 盐胁迫, 生物信息学

Abstract:

To reveal the function of transcription factor PsnbZIP1 from Populus simonii × P. nigra under abiotic stresses， P.simonii × P. nigra was used as material， and the PsnbZIP1 transcription factor gene was cloned with an ORF length of 432 bp， and the molecular mechanism of PsnbZIP1 under salt stress was analyzed. The expression pattern of PsnbZIP1 in P. simonii × P. nigra was analyzed under 150 mmol·L^-1 NaCl by q-PCR， it was found that the expression of the gene increased rapidly. The PsnbZIP1 was predicted to be a hydrophilic unstable protein without trans-membrane structure but with signal peptide by bioinformatics analysis. The sub-cellular localization of the gene was observed by Agrobacterium mediated transient expression in tobacco. The results showed that the gene was a nuclear localization protein. It was confirmed by Y2HGold yeast competent cells that the gene had no transcriptional activation activity in yeast. The analysis of the promoter sequence of the PsnbZIP1 gene showed that the promoter contained auxin response elements， ABA response elements， light response elements and seed-specific cis-acting regulatory elements respectively， which might play a role in plant growth and development and response to stress.The promoter also included the MYB binding site and MYBHv1 binding site involved in drought induction， indicating that the gene was likely to interact with some of MYB involved in drought induction.

Key words: Populus simonii × P.nigra, bZIPtranscription factor, salt stress, bioinformatics analysis

中图分类号:

S722.3+6

廖诗贤, 王宇婷, 董立本, 顾咏梅, 贾丰璘, 姜廷波, 周博如. 小黑杨转录因子PsnbZIP1应答盐胁迫功能分析[J]. 植物研究, 2023, 43(2): 288-299.

Shixian LIAO, Yuting WANG, Liben DONG, Yongmei GU, Fenglin JIA, Tingbo JIANG, Boru ZHOU. Function Analysis of the Transcription Factor PsnbZIP1 of Populus simonii×P. nigra in Response to Salt Stress[J]. Bulletin of Botanical Research, 2023, 43(2): 288-299.

图/表 12

表1

表2

图1

图2

图3

表3

图4

图5

图6

图7

图8

表4

参考文献 25

1	赵凯.84K杨转录因子PagMYB73调控耐盐胁迫的分子机理研究［D］.哈尔滨：东北林业大学，2021.
	ZHAO K.Study on molecular mechanism of 84K poplar transcription factor PagMYB73 regulating salt stress tolerance［D］.Harbin：Northeast Forestry University，2021.
2	冷春旭，郑福余，赵北平，等.水稻耐碱性研究进展［J］.生物技术通报，2020，36（11）：103-111.
	LENG C X， ZHENG F Y， ZHAO B P，et al.Advances on alkaline tolerance of rice［J］.Biotechnology Bulletin，2020，36（11）：103-111.
3	毛恋，芦建国，江海燕.植物响应盐碱胁迫的机制［J］.分子植物育种，2020，18（10）：3441-3448.
	MAO L， LU J G， JIANG H Y.Mechanisms of plant responses to salt-alkali stress［J］.Molecular Plant Breeding，2020，18（10）：3441-3448.
4	DANDEKAR T， ARGOS P.The GCN4 basic region leucine zipper binds DNA as a dimer of uninterrupted alpha helices：crystal structure of the protein-DNA complex［J］.Cell，1992，71（7）：1223-1237.
5	JAKOBY M， WEISSHAAR B， DRGE-LASER W，et al.bZIP transcription factors in Arabidopsis ［J］.Trends in Plant Science，2002，7（3）：106-111.
6	SCHUTZE K， HARTER K， CHABAN C.Post-translational regulation of plant bZIP factors［J］.Trends in Plant Science，2008，13（5）：247-255.
7	WANG Y， GAO C， LIANG Y，et al.A novel bZIP gene from Tamarix hispida mediates physiological responses to salt stress in tobacco plants［J］.Journal of Plant Physiology，2010，167（3）：222-230.
8	ZHAO K， CHEN S， YAO W，et al.Genome-wide analysis and expression profile of the bZIP gene family in poplar［J］.BMC Plant Biology，2021，21（122）.
9	王升级，孙赫，党慧.盐胁迫条件下杨树bZIP转录因子全基因组分析［J］.山西农业大学学报（自然科学版），2018，38（8）：1-7，14.
	WANG S J， SUN H， DANG H.Genome-wide analysis of the bZIP transcription factors in Populus in response to salt stress［J］.Journal of Shanxi Agricultural University（Natural Science Edition），2018，38（8）：1-7，14.
10	RAQUEL，IGLESIAS-FERNÁNDEZ，CRISTINA，et al. Arabidopsis thaliana bZIP44：a transcription factor affecting seed germination and expression of the mannanase-encoding gene AtMAN7［J］.The Plant Journal，2013，74（5）：767-780.
11	CIFUENTES-ESQUIVEL N， CELIZ-BALBOA J，HENRIQUEZ-VALENCIAC，et al.bZIP17 regulates the expression of genes related to seed storage and germination，reducing seed susceptibility to osmotic stress［J］.Journal of Cellular Biochemistry，2018，119（8）：6857-6868.
12	YOSHIDA T， FUJITA Y， SAYAMA H，et al.AREB1，AREB2，and ABF3 are master transcription factors that cooperatively regulate ABRE-dependent ABA signaling involved in drought stress tolerance and require ABA for full activation［J］.The Plant Journal，2010，61：672-685.
13	杜兆伟，郑唐春，李爽，等.小黑杨快繁与再生体系的优化［J］.植物研究，2015，35（6）：904-907，914.
	DU Z W， ZHENG T C， LI S，et al.Rapid Propagation and Regeneration System of Populus simonii × Populus nigra ［J］.Bulletin of Botanical Research，2015，35（6）：904-907，914.
14	鲜孟君，张双双，刘建祥，等.拟南芥膜相关转录因子bZIP60活化后与转录因子MYB7互作共同调控种子萌发［J］.复旦学报（自然科学版），2016，55（5）：632-641.
	XIAN M J， ZHANG S S， LIU J X，et al.Membrane-Associated transcription factor，bZIP60，is activated by ABA and interacts with MYB7 to regulate seed germination in Arabidopsis ［J］.Journal of Fudan University（Natural Science），2016，55（5）：632-641.
15	唐宁.水稻逆境相关bZIP转录因子的功能鉴定［D］.武汉：华中农业大学，2013.
	TANG N.Functional Characterization of Rice Stress-Related bZIP Transcription Factors［D］.Wuhan：Huazhong Agricultural University，2013.
16	RAGHAVENDRA A S， GONUGUNTA V K， CHRISTMANN A，et al.ABA perception and signalling.［J］.Trends in Plant Science，2010，15（7）：395-401.
17	YONG X， NING T， HAO D，et al.Characterization of OsbZIP23 as a key player of the basic leucine zipper transcription factor family for conferring abscisic acid sensitivity and salinity and drought tolerance in rice［J］.Plant Physiology，2008，148（4）：1938-1952.
18	LI C， LÜ J， ZHAO X，et al.TaCHP：A wheat zinc finger protein gene down-regulated by abscisic acid and salinity stress plays a positive role in stress tolerance［J］.Plant Physiology，2010，154（1）：211-221.
19	FREY A，GODINBÉATRICE， BONNET M，et al.Maternal synthesis of abscisic acid controls seed development and yield in Nicotiana plumbaginifolia ［J］.Planta，2004，218（6）：958.
20	WHITE C N.Gibberellins and seed development in maize.Ⅰ.evidence that gibberellin/abscisic acid balance governs germination versus maturation pathways［J］.Plant physiology，2000，122（4）：1081-1088.
21	AUDRAN C， BOREL C， FREY A，et al.Expression studies of the zeaxanthin epoxidase gene in nicotiana plumbaginifolia［J］.Plant Physiology，1998，118（3）：1021.
22	刘一灵，李振华，刘仁祥.植物激素ABA调控种子发育与萌发的研究进展［J］.种子，2014，33（10）：47-50.
	LIU Y L， LI Z H， LIU R X.The research of ABA regulation in seed development and germination［J］.Seed，2014，33（10）：47-50.
23	WEI Q， LUO Q， WANG R，et al.A wheat R2R3-type MYB transcription factor TaODORANT1 positively regulates drought and salt stress responses in transgenic tobacco plants［J］.Frontiers in Plant Science，2017，8：1374.
24	LI X W， WANG Y， YAN F，et al.Overexpression of soybean R2R3-MYB transcription factor，GmMYB12B2，and tolerance to UV radiation and salt stress in transgenic Arabidopsis ［J］.Genetics and Molecular Research，2016，15（2）.doi：10.4238/gmr.15026573 .
25	罗霄.基因调控网络构建方法研究［D］.大连：大连理工大学，2020.
	LUO X.Research on Gene Regulatory Networks Construction［D］.Dalian：Dalian University of Technology，2020.

引物 Primer	引物序列（5′→3′） Sequence（5′→3′）
PsnbZIP1-F	CTCACACAACAACATTTACG
PsnbZIP1-R	ACAGCATAACCAGAGAAATC
qRT-PsnbZIP1-F	TGAAAAGTTGAAGTTGGCAG
qRT-PsnbZIP1-R	AACTTTGAACATCCCAGAAG
Actin-F	ACCCTCCAATCCAGACACTG
Actin-R	TTGCTGACCGTATGAGCAAG
pBI121-PsnbZIP1-GFP-F	GTCGACATGCCACCATCCTTTGCAAA
pBI121-PsnbZIP1-GFP-R	ACTAGTAACTTTGAACATCCCAGAAG
pBi121-GFP-F1	CCATCGTTGAAGATGCCTCTGC
pBi121-GFP-R1	CAACGCTGATCAATTCCACAG
PsnbZIP1-BD-F	CATATGATGCCACCATCCTTTGCAAA
PsnbZIP1-BD-R	GAATTCCTAAACTTTGAACATCCCAG
BD-F	GTAATACGACTCACTATAGGGCGA
BD-R	TTTCGTTTTAAAACCTAAGAGTC
Pro-PsnbZIP1-F	GGTGCCCAGTAATTACCC
Pro-PsnbZIP1-R	GCAAAGGATGGTGGCATTTT
PsnbZIP1-BD-N-F	GAATTCATGCCACCATCCTTTGCAAAG
PsnbZIP1-BD-N-R	GGATCCAGCAAAATGCCTTTGCCAAAG
PsnbZIP1-BD-C-F	GAATTCCTCGAATCAGACAACGAAGTC
PsnbZIP1-BD-C-R	GGATCCCTAAACTTTGAACATCCCAGA

胁迫时间 /h	相对表达量 Relative expression levels
胁迫时间 /h	根 Root	茎 Stem	叶 Leaf
0	1.000a	1.000a	1.000a
3	（18.835±0.450）b	（16.992±0.325）b	（10.931±0.326）b
6	（38.487±0.394）b	（22.681±0.397）b	（24.564±0.382）b
12	（89.583±0.421）b	（79.792±0.382）b	（43.637±0.153）b
24	（75.107±0.387）b	（217.259±0.298）b	（52.146±0.159）b
48	（126.280±0.207）b	（156.977±0.280）b	（47.963±0.326）b

指标 Indicator	位点 Site	得分 Score
原始剪切位点的分值（Max. C） Score for original splice site （Max. C）	20	0.323
综合剪切位点的分值（Max. Y） Scores for integrated splicing site （Max. Y）	20	0.481
信号肽的分值（Max. S） Signal Peptide Score （Max. S）	13	0.804
信号肽分值的平均值（Mean. S） Mean value of signal peptide score （Mean. S）	1-19	0.724
Mean. S和Max. Y的加权平均值（D） Weighted mean of Mean. S and Max. Y（D）	1-19	0.612

作用元件 Acting element	序列 Sequence	功能 Function
G-box	TACGTG/CACGTG	参与光反应性的顺式作用调节元件 cis-acting regulatory element involved in light responsiveness
ABRE	CGTACGTGCA/CACGTG	参与脱落酸响应性的顺式作用元件 cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness
TGA-element	AACGAC	生长素应答元件 Auxin-responsive element
MRE	AACCTAA	涉及光响应的 MYB 结合位点 MYB binding site involved in light responsiveness
TATA-box	TATA	转录开始-30左右的核心启动子元件 Core promoter element around-30 of transcription start
CCAAT-box	CAACGG	MYBHv1 结合位点 MYBHv1 binding site MYBHv1
MBS	CAACTG	参与干旱诱导的 MYB 结合位点 MYB binding site involved in drought-inducibility
4cl-CMA1b	ATTCCGATAAACT	光响应元件 Light responsive element
Box4	ATTAAT	参与光响应性的保守 DNA 模块的一部分 Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness
ATCT-motif	AATCTAATCC	参与光响应性的保守 DNA 模块的一部分 Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness
RY-element	CATGCATG	参与种子特异性调控的顺式作用调控元件 cis-acting regulatory element involved in seed-specific regulation
IBox	AAGATAAGGCT	光响应元件的一部分 Part of a light responsive element
ARE	AAACCA	厌氧诱导所必需的顺式作用调节元件 cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction
CAAT-box	CCAAT	启动子和增强子区域的共同顺式作用元件 Common cis-acting element in promoter and enhancer regions
AE-box	AGAAACAA	光响应模块的一部分 Part of a module for light response

[1]	何旭, 高源, 张群野, 周晨光, 李伟, 李爽. 白城小黑杨遗传转化体系建立及其应用[J]. 植物研究, 2023, 43(5): 667-678.
[2]	隋德宗, 王保松. 盐胁迫下乌桕无性系叶片的比较蛋白组学研究[J]. 植物研究, 2023, 43(5): 679-689.
[3]	徐磊, 胥晓, 刘沁松. 外源水杨酸对盐胁迫下珙桐幼苗抗氧化系统和基因表达的影响[J]. 植物研究, 2023, 43(4): 572-581.
[4]	郑占敏, 商玉冰, 周广波, 肖迪, 刘轶, 由香玲. PsnHB13与PsnHB15在小黑杨中的遗传转化与功能分析[J]. 植物研究, 2023, 43(3): 340-350.
[5]	刘森尧, 贾丰璘, 国庆, 樊高锋, 周博如, 姜廷波. 小黑杨转录因子PsnbHLH162基因在盐和低温胁迫下应答分析[J]. 植物研究, 2023, 43(2): 300-310.
[6]	黄安瀛, 夏德安, 张洋, 那冬晨, 燕青, 魏志刚. PtrWRKY51基因的克隆及抗旱表达特性分析[J]. 植物研究, 2022, 42(6): 1005-1013.
[7]	陈华峰, 代龙军, 刘明洋, 郭冰冰, 杨洪, 王立丰. 橡胶树胶乳高表达热激蛋白HbHSP90.4基因抗逆功能分析[J]. 植物研究, 2022, 42(6): 1023-1032.
[8]	李登高, 林睿, 穆青慧, 周娜, 张焱如, 白薇. 马铃薯StCRKs基因家族的鉴定分析及响应逆境信号的表达[J]. 植物研究, 2022, 42(6): 1033-1043.
[9]	岳莉然, 刘颖婕, 刘晨旭, 周蕴薇. 响应盐胁迫调控的露地菊miR398a的克隆及功能研究[J]. 植物研究, 2022, 42(6): 986-996.
[10]	刘明洋, 肖化兴, 王立丰, 梁晓宇, 张宇, 王萌. 橡胶树热激蛋白HbHSP90.8-1基因的克隆与功能分析[J]. 植物研究, 2022, 42(5): 811-820.
[11]	李登高, 林睿, 穆青慧, 周娜, 张焱如, 白薇. 马铃薯StNPR4基因的克隆与功能分析[J]. 植物研究, 2022, 42(5): 821-829.
[12]	王宏鹏, 李一丹, 汪耀, 谭晓宇, 陈成彬, 张力鹏. 菊叶薯蓣DcPMK基因克隆及互作蛋白筛选[J]. 植物研究, 2022, 42(5): 855-865.
[13]	王雪莹, 王瑞琪, 张洋, 刘聪, 夏德安, 魏志刚. 毛果杨CNGC家族全基因组鉴定及胁迫响应分析[J]. 植物研究, 2022, 42(4): 613-625.
[14]	陈娇娆, 续旭, 胡章立, 杨爽. 植物感受盐胁迫及相关钙信号的研究进展[J]. 植物研究, 2022, 42(4): 713-720.
[15]	陈思思, 谢牧洪, 崔茂凯, 李文凯, 徐正刚, 贾彩霞, 杨桂燕. 构树转录因子BpbZIP1的鉴定及镉胁迫响应分析[J]. 植物研究, 2022, 42(3): 394-402.