巴西橡胶树去泛素化酶UCHs基因的克隆及功能分析

doi:10.7525/j.issn.1673-5102.2023.04.015

植物研究 ›› 2023, Vol. 43 ›› Issue (4): 622-630.doi: 10.7525/j.issn.1673-5102.2023.04.015

巴西橡胶树去泛素化酶UCHs基因的克隆及功能分析

袁铭悦¹^,², 周天忠²^,³, 余马¹, 胡斌², 龙翔宇², 陈华¹()

^1.西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳 621010
^2.中国热带农业科学院橡胶研究所/农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室/农业农村部儋州热带作物科学观测试验站，海口 571101
^3.云南农业大学普洱学院，普洱 665099

收稿日期:2023-03-19 出版日期:2023-07-20 发布日期:2023-07-03
通讯作者: 陈华 E-mail:hchen@swust.edu.cn
作者简介:袁铭悦（1998—），女，硕士研究生，主要从事橡胶树产胶分子生物学方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(31971680);海南省自然科学基金创新团队项目(322CXTD526);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1630022022009);西南科技大学博士基金项目(19ZX7117)

Cloning and Functional Analysis of Deubiquitinating Enzyme Gene UCHs from Hevea brasiliensis

Mingyue YUAN¹^,², Tianzhong ZHOU²^,³, Ma YU¹, Bin HU², Xiangyu LONG², Hua CHEN¹()

^1.School of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010
^2.Rubber Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，P. R. China/State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops/Danzhou Investigation & Experiment Station of Tropical Crops，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，CATAS，Haikou 571101
^3.Pu'er University，Yunnan Agricultural University，Puer 665099

Received:2023-03-19 Online:2023-07-20 Published:2023-07-03
Contact: Hua CHEN E-mail:hchen@swust.edu.cn
About author:YUAN Mingyue（1998—），female，master student，molecular biology of rubber production from rubber trees.
Supported by:
Project of National Natural Science Foundation of China(31971680);Innovation Team Project of Hainan Natural Science Foundation(322CXTD526);Special Project of Basic Research Funds for Public Welfare Research Institutes of the Central Government(1630022022009);Southwest University of Science and Technology,PhD Foundation Project(19ZX7117)

摘要/Abstract

摘要：

为探究去泛素化酶中泛素羧基末端水解酶（UCHs）在巴西橡胶树乳管泛素化过程中发挥的潜在功能，从巴西橡胶树中成功分离2个UCHs家族成员（HbUCH-L3和HbUCH-L5）的全长序列，开放阅读框分别长993、558 bp，编码330、185个氨基酸，具有典型的UCHs结构域；qRT-PCR结果表明HbUCH-L3和HbUCH-L5在各组织中均有表达，且在胶乳中表达丰度较低；HbUCHs重组蛋白的体外泛素化底物切割试验表明，HbUCH-L3和HbUCH-L5均具有水解泛素的功能。HbUCHs显著降低C乳清中总蛋白整体泛素化水平，且HbUCH-L3去泛素化酶活性高于HbUCH-L5。由此推测橡胶树UCHs在乳管中参与维持泛素化动态平衡进而发挥其特定的生物学功能，但具体的作用及调控机制尚不清楚。

关键词: 巴西橡胶树, 泛素羧基末端水解酶, 乳管泛素化, 体外泛素化底物切割

Abstract:

To investigate the potential function of ubiquitin carboxyl terminal hydrolases（UCHs） in the ubiquitination process of laticiferous of Hevea brasiliensis， the full-length sequences of two UCHs family members（HbUCH-L3 and HbUCH-L5） were isolated from Hevea brasiliensis， and both had typical UCHs domains. The open reading frame of HbUCH-L3 and HbUCH-L5 were 993 bp and 558 bp， and encoded 330 and 185 amino acids， respectively. The results of qRT-PCR showed that HbUCH-L3 and HbUCH-L5 were constitutively expressed in all tissues， but was low in latex. In vitro ubiquitination substrates cleavage of recombinant HbUCHs showed that both HbUCH-L3 and HbUCH-L5 had the function of hydrolyzing ubiquitin. HbUCHs significantly reduced the overall ubiquitination level of C-serum proteins； while， the deubiquitinating activity of HbUCH-L3 was higher than that of HbUCH-L5. Therefore， it was speculated that UCHs played a role in maintaining the dynamic balance of laticiferous ubiquitination and thus played a specific biological function， but the exact mechanism was still unclear.

Key words: Hevea brasiliensis, ubiquitin carboxy-terminal hydrolases, laticiferous ubiquitination, in vitro ubiquitination substrate cleavage

中图分类号:

S794.1

袁铭悦, 周天忠, 余马, 胡斌, 龙翔宇, 陈华. 巴西橡胶树去泛素化酶UCHs基因的克隆及功能分析[J]. 植物研究, 2023, 43(4): 622-630.

Mingyue YUAN, Tianzhong ZHOU, Ma YU, Bin HU, Xiangyu LONG, Hua CHEN. Cloning and Functional Analysis of Deubiquitinating Enzyme Gene UCHs from Hevea brasiliensis[J]. Bulletin of Botanical Research, 2023, 43(4): 622-630.

图/表 7

表1

图1

图2

图3

图4

图5

图6

参考文献 33

1	金华斌，田维敏，史敏晶.我国天然橡胶产业发展概况及现状分析［J］.热带农业科学，2017，37（5）：98-104.
	JIN H B， TIAN W M， SHI M J.Current situation and industrial development of natural rubber in China［J］.Chinese Journal of Tropical Agriculture，2017，37（5）：98-104.
2	安锋，林位夫，谢贵水，等.国内外巴西橡胶树替代作物及技术研发现状［J］.热带作物学报，2012，33（6）：1134-1141.
	AN F， LIN W F， XIE G S，et al.Development of alternative natural rubber producing crops and techniques［J］.Chinese Journal of Tropical Crops，2012，33（6）：1134-1141.
3	ZHU J H， ZHANG Z L.Ethylene stimulation of latex production in Hevea brasiliensis ［J］.Plant Signaling & Behavior，2009，4（11）：1072-1074.
4	ZHANG Y.Transcriptional regulation by histone ubiquitination and deubiquitination［J］.Genes & Development，2003，17（22）：2733-2740.
5	崔超，赵阿慧，李芳，等.泛素/26S蛋白酶体途径调节作物种子大小的研究进展［J］.中国农业科技导报，2021，23（9）：19-29.
	CUI C， ZHAO A H， LI F，et al.Research progress of ubiquitin/26S proteasome pathway regulating crop seed size［J］.Journal of Agricultural Science and Technology，2021，23（9）：19-29.
6	曹孝强，于菲菲，谢旗.泛素化修饰调控植物非生物逆境响应［J］.中国基础科学，2020，22（1）：7-10.
	CAO X Q， YU F F， XIE Q.Protein ubiquitination-mediated abiotic stress response in plants［J］.China Basic Science，2020，22（1）：7-10.
7	田爱梅，于晖，曹家树.植物E3泛素连接酶的分类与功能［J］.中国细胞生物学学报，2020，42（5）：907-915.
	TIAN A M， YU H， CAO J S.Classification and function of E3 ubiquitin ligase in plants［J］.Chinese Journal of Cell Biology，2020，42（5）：907-915.
8	李招娣，兰秋艳，李衍常，等.定量蛋白质组学揭示酵母去泛素化酶Ubp14生物学功能［J］.生物工程学报，2022，38（10）：3901-3913.
	LI Z D， LAN Q Y， LI Y C，et al.Quantitative proteomics reveal the potential biological functions of the deubiquitinating enzyme Ubp14 in Saccharomyces cerevisiae ［J］.Chinese Journal of Biotechnology，2022，38（10）：3901-3913.
9	程岚，刘春燕，刘琼，等.植物UBP类去泛素化酶功能研究进展［J］.植物生理学报，2023，59（3）：433-441.
	CHEN L， LIU C Y， LIU Q，et al.Advances in functional studies of plant UBP deubiquitinating enzymes［J］.Plant Physiology Journal，2023，59（3）：433-441.
10	KULATHU Y， KOMANDER D.Atypical ubiquitylation：the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages［J］.Nature Reviews Molecular Cell Biology，2012，13（8）：508-523.
11	NIJMAN S M B， LUNA-VARGAS M P A， VELDS A，et al.A genomic and functional inventory of deubiquitinating enzymes［J］.Cell，2005，123（5）：773-786.
12	HUANG T T， NIJMAN S M B， MIRCHANDANI K D，et al.Regulation of monoubiquitinated PCNA by DUB autocleavage［J］.Nature Cell Biology，2006，8（4）：341-347.
13	DOELLING J H， YAN N， KUREPA J，et al.The ubiquitin‐specific protease UBP14 is essential for early embryo development in Arabidopsis thaliana ［J］.The Plant Journal，2001，27（5）：393-405.
14	YANG P Z， SMALLE J， LEE S，et al.Ubiquitin C‐terminal hydrolases 1 and 2 affect shoot architecture in Arabidopsis［J］.The Plant Journal，2007，51（3）：441-457.
15	LONG X Y， FANG Y J， QIN Y X，et al.Latex-specific transcriptome analysis reveals mechanisms for latex metabolism and natural rubber biosynthesis in laticifers of Hevea brasiliensis［J］.Industrial Crops and Products，2021，171：113835.
16	APPEL R D， BAIROCH A， HOCHSTRASSER D F.A new generation of information retrieval tools for biologists：the example of the ExPASy WWW server［J］.Trends in Biochemical Sciences，1994，19（6）：258-260.
17	TANZ S K， CASTLEDEN I， SMALL I D，et al.Fluorescent protein tagging as a tool to define the subcellular distribution of proteins in plants［J］.Frontiers in Plant Science，2013，4：214.
18	ALMAGRO ARMENTEROS J J， TSIRIGOS K D， SØNDERBY C K，et al.SignalP 5.0 improves signal peptide predictions using deep neural networks［J］.Nature Biotechnology，2019，37（4）：420-423.
19	KROGH A， LARSSON B， VON HEIJNE G，et al.Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model：application to complete genomes［J］.Journal of Molecular Biology，2001，305（3）：567-580.
20	KUMAR S， TAMURA K，NEI M.MEGA：molecular evolutionary genetics analysis software for microcomputers［J］.Bioinformatics，1994，10（2）：189-191.
21	WANG D H， SONG W， WEI S W，et al.Characterization of the ubiquitin C-terminal hydrolase and ubiquitin-specific protease families in rice（Oryza sativa）［J］.Frontiers in Plant Science，2018，9：1636.
22	RONG C， ZHOU R， WAN S，et al.Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolases and human malignancies：the novel prognostic and therapeutic implications for head and neck cancer［J］.Frontiers in Oncology，2021，10：592501.
23	黄浩.泛素羧基端水解酶UCH家族水解反应动力学研究［D］.苏州：苏州大学，2009.
	HUANG H.Study on the activity and dynamics of ubiquitin C-terminal hydrolase［D］.Suzhou：Soochow University，2009.
24	LEE Y T C， CHANG C Y， CHEN S Y，et al.Entropic stabilization of a deubiquitinase provides conformational plasticity and slow unfolding kinetics beneficial for functioning on the proteasome［J］.Scientific Reports，2017，7（1）：1-14.
25	任禹静，王丰.泛素羧基末端水解酶L3的研究进展［J］.生命科学仪器，2020，18（2）：14-22.
	REN Y J， WANG F.Advances in the study of ubiquitin C-terminal hydrolase L3［J］.Life Science Instruments，2020，18（2）：14-22.
26	牛彤旭，王张，宝鲁日，等.UCH-L3和HIF-1α在乳腺良恶性病变中的表达和临床意义［J］.海南医学院学报，2021，27（3）：174-179.
	NIU T X， WANG Z， BAO L R，et al.Expression and clinical significance of UCH-L3 and HIF-1a in breast benign and malignant lesions［J］.Journal of Hainan Medical University，2021，27（3）：174-179.
27	陈立杰，方远鹏，杜巧丽，等.水稻去泛素化酶OsUCH-L5基因的克隆及表达分析［J］.种子，2021，40（3）：45-51.
	CHEN L J， FANG Y P， DU Q L，et al.Cloning and expression analysis of OsUCH-L5 gene encoded rice deubiquitin enzyme［J］.Seed，2021，40（3）：45-51.
28	OLDAK L， CHLUDZINSKA-KASPERUK S， MILEWSKA P，et al.MMP-1，UCH-L1，and 20S proteasome as potential biomarkers supporting the diagnosis of brain glioma［J］.Biomolecules，2022，12（10）：1477.
29	尉娜，路坦，谭军.脑梗死患者静脉溶栓疗程中泛素羧基末端水解酶L1和缺血修饰白蛋白水平的动态变化及临床意义［J］.中国心血管杂志，2022，27（3）：263-268.
	WEI N， LU T， TAN J.Dynamic changes and clinical significance of ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1 and ischemia-modified albumin levels during intravenous thrombolysis in patients with cerebral infarction［J］.Chinese Journal of Cardiovascular Medicine，2022，27（3）：263-268.
30	丁珊，任禹静，姜凌，等.磷酸化对UCHL3体外去泛素化酶活性的影响［J］.生物技术进展，2019，9（5）：527-535.
	DING S， REN Y J， JIANG L，et al.Effect of phosphorylation on deubiquitinase activity of UCHL3 in vitro［J］.Current Biotechnology，2019，9（5）：527-535.
31	WOLBERGER C.Mechanisms for regulating deubiquitinating enzymes［J］.Protein Science，2014，23（4）：344-353.
32	PICKART C M， ROSE I A.Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase acts on ubiquitin carboxyl-terminal amides［J］.Journal of Biological Chemistry，1985，260（13）：7903-7910.
33	魏芳，校现周，刘实忠.适合巴西橡胶树胶乳C-乳清蛋白双向电泳技术的建立［J］.热带作物学报，2009，30（11）：1618-1623.
	WEI F， XIAO X Z， LIU S Z.Establishment of a two-dimensional electrophoresis technology for latex C-serum of Hevea brasiliensis［J］.Chinese Journal of Tropical Crops，2009，30（11）：1618-1623.

引物名称 Primer name	引物序列（5′→3′） Primer sequence（5′→3′）	备注 Note
HbUCH-L3-F	ATTGTGTAGTTCCTTTGGGGCTTAG	HbUCH-L3基因克隆全长引物 Cloning of full-length primers of HbUCH-L3 gene
HbUCH-L3-R	CAGAAAATTATTCCCTGCATGTCT
HbUCH-L5-F	AATCCTGAAGATCCAAGCATTTTCC	HbUCH-L5基因克隆全长引物 Cloning of full-length primers of HbUCH-L5 gene
HbUCH-L5-R	TGCCAAAAATATGCTAAAAAAGTC
HbUCH-L3-qp-F	TGGAGCGTGCTGCATATCTT	HbUCH-L3实时定量PCR引物 HbUCH-L3 real-time quantitative PCR primer
HbUCH-L3-qp-R	AGTTCTCCTTCCACACACGC
HbUCH-L5-qp-F	TGGACTGGTTGCGTATGGTG	HbUCH-L5实时定量PCR引物 HbUCH-L5 real-time quantitative PCR primer
HbUCH-L5-qp-R	CCTCCTTTGCAGCTCCTTGA
HbYLS8-qp-F	CCTCGTCGTCATCCGATTC	实时定量PCR内参引物 Real-time quantitative PCR internal reference primers
HbYLS8-qp-R	CAGGCACCTCAGTGATGTC
HbUCH-L3-MBP-F	TTGCGGCCGCATGGTTCCGAAGCCTGTTCTT	HbUCH-L3原核表达引物 HbUCH-L3 prokaryotic expression primer
HbUCH-L3-MBP-R	CGGTCGACTTAAATTGCACCTTCAGCTTTC	HbUCH-L3原核表达引物 HbUCH-L3 prokaryotic expression primer
HbUCH-L5-MBP-F	TTGCGGCCGCATGTCTTGGTGCACTATTGAGT	HbUCH-L5原核表达引物 HbUCH-L5 prokaryotic expression primer
HbUCH-L5-MBP-R	CGGTCGACTCATGTTTTTTGCTTGGCCTTC	HbUCH-L5原核表达引物 HbUCH-L5 prokaryotic expression primer

[1]	覃碧, 刘明洋, 王萌, 王立丰, 黄飞. 橡胶树DELLA基因HbRGL1的克隆与表达分析[J]. 植物研究, 2022, 42(6): 997-1004.
[2]	代龙军, 刘明洋, 阳江华, 周凯, 郭冰冰, 杨洪, 王立丰. 巴西橡胶树胶乳中DUF1262结构域蛋白结构与基因表达分析[J]. 植物研究, 2022, 42(5): 802-810.
[3]	陈华峰, 樊松乐, 王立丰. 巴西橡胶树赤霉素信号转导途径HbRGA1结构和功能分析[J]. 植物研究, 2021, 41(4): 531-539.
[4]	樊松乐, 王纪坤, 谢贵水, 王萌, 王立丰. R2R3型MYB转录因子HbMYB88结构和功能分析[J]. 植物研究, 2020, 40(1): 106-116.
[5]	王萌, 张冬, 陆燕茜, 肖化兴, 郑服丛, 张宇. 巴西橡胶树中小檗碱桥酶HbBBE1在逆境胁迫中的作用[J]. 植物研究, 2018, 38(5): 704-713.
[6]	陆燕茜, 张冬, 王立丰, 王纪坤. 巴西橡胶树HbMYB62转录因子基因的克隆和表达分析[J]. 植物研究, 2017, 37(6): 953-960.
[7]	张冬, 李晓娜, 肖厚贞, 陆燕茜, 张宇, 王萌. 巴西橡胶树6个PP2C家族基因成员分子信息学与抗旱功能分析[J]. 植物研究, 2017, 37(5): 730-737.

巴西橡胶树去泛素化酶UCHs基因的克隆及功能分析

Cloning and Functional Analysis of Deubiquitinating Enzyme Gene UCHs from Hevea brasiliensis

RichHTML

PDF (PC)

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表 7

参考文献 33

相关文章 7

编辑推荐

Metrics

本文评价