Establishment of Genetic Transformation System for ‘Populus leucopyramidalis 1’ and Transformation of Insect Resistance Gene

doi:10.7525/j.issn.1673-5102.2024.03.005

Abstract

Abstract:

‘Populus leucopyramidalis 1’ is an excellent poplar clone with narrow crown and saline-alkali tolerance. Due to the lack of its genetic transformation system， genetic improvement could not be achieved through genetic engineering methods. In this study， an Agrobacterium mediated genetic transformation system of ‘P. leucopyramidalis 1’ was established and the high genetic transformation efficiency was achieved. Firstly， the tissue culture seedlings were subcultured at different time periods（35， 45， 55， 65 d）， and three types of tissues（leaves， petioles， and stem segments） were taken to compare the differentiation ability， and it was determined that the leaves sub-cultured after 45 d had the strongest differentiation ability， with a proliferation ratio of 8.77. Then， leaves sub-cultured after 45 d were used for genetic transformation， and the effects of different infection conditions on the transformation rate were examined. Orthogonal experiments were established with three gradients of bacterial concentration， infection time， and co-culture time to screen the best levels of these three factors， and the transgenic strains were identified through PCR detection and GUS staining. The results showed that the optimal combination for the genetic transformation system of ‘P. leucopyramidalis 1’ was bacterial concentration OD₆₀₀=0.4， infection-time 15 min， and co-cultivation time 2 d could reach the highest transformation rate 54.23%. Finally， the ‘P. leucopyramidalis 1’ transgenic strain of BtCry3Aa insect resistant gene using this genetic transformation system was obtained， and the results proved that this system could be an effective method for genetic improvement of ‘P. leucopyramidalis 1’.

Key words: ‘Populus leucopyramidalis 1’, genetic transformation system, BtCry3Aa

CLC Number:

S792.11

Dongyue WANG, Ruyue WANG, Maotong SUN, Cuishuang LIU, Jihong LI. Establishment of Genetic Transformation System for ‘Populus leucopyramidalis 1’ and Transformation of Insect Resistance Gene[J]. Bulletin of Botanical Research, 2024, 44(3): 361-369.

Figures/Tables 12

Fig.1

Table 1

Table 2

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Table 3

Fig.3

Table 4

Fig.4

Fig.5

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References 30

1	郑涛，樊军锋，张海燕.秦白杨3号扦插繁育技术研究［J］.西北林学院学报，2019，34（5）：122-126.
	ZHENG T， FAN J F， ZHANG H Y.Cutting technology of the poplar cultivar ‘Qin Baiyang No.3’［J］.Journal of Northwest Forestry University，2019，34（5）：122-126.
2	庞金宣.白杨派树种杂交育种研究报告［J］.山东林业科技，1986（4）：5-12.
	PANG J X.Research report on hybrid breeding of poplar tree species［J］.Journal of Shandong Forestry Science and Technology，1986（4）：5-12.
3	毛秀红，姚俊修，李善文，等.杨树新品种‘鲁白杨1号’［J］.园艺学报，2018，45（S2）：2835-2836.
	MAO X H， YAO J X， LI S W，et al.A new cultivar of ‘Populus Lubaiyang 1’［J］.Acta Horticulturae Sinica，2018，45（S2）：2835-2836.
4	毛秀红，姚俊修，王丽，等.杨树新品种‘鲁白杨2号’［J］.园艺学报，2018，45（S2）：2837-2838.
	MAO X H， YAO J X， WANG L，et al.A new cultivar of ‘Populus Lubaiyang 2’［J］.Acta Horticulturae Sinica，2018，45（S2）：2837-2838.
5	胡建军，杨敏生，卢孟柱.我国抗虫转基因杨树生态安全性研究进展［J］.生物多样性，2010，18（4）：336-345.
	HU J J， YANG M S， LU M Z.Advances in biosafety studies on transgenic insect-resistant poplars in China［J］.Biodiversity Science，2010，18（4）：336-345.
6	王桂英.双Bt基因对杨树的遗传转化及外源基因表达研究［D］.保定：河北农业大学，2013.
	WANG G Y.Study on genetic transformation and exogenous double Bt genes expression in poplar［D］.Baoding：Hebei Agricultural University，2013.
7	HERRNSTADT C， GILROY T E， SOBIESKI D A，et al.Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of a coleopteran-active delta-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis subsp.san diego ［J］.Gene，1987，57（1）：37-46.
8	SONG C W， LU L， GUO Y Y，et al.Efficient Agrobacterium-mediated transformation of the commercial hybrid poplar Populus alba × Populus glandulosa Uyeki［J］.International Journal of Molecular Sciences，2019，20（10）：2594.
9	王如月，王雪菱，李际红，等.美洲黑杨杂交良种‘鲁林9号杨’离体再生体系的建立［J］.西北林学院学报，2022，37（2）：83-89.
	WANG R Y， WANG X L， LI J H，et al.Establishment of in vitro regeneration system of Populus deltoides ‘Lulin 9’［J］.Journal of Northwest Forestry University，2022，37（2）：83-89.
10	汪玲，项艳.725杨组培繁殖技术研究［J］.安徽农业大学学报，2013，40（4）：612-617.
	WANG L， XIANG Y.Research on tissue culture and propagation of Populus deltoides cl.‘725’［J］.Journal of Anhui Agricultural University，2013，40（4）：612-617.
11	周熙莹.84K杨再生和遗传转化体系的研究［D］.哈尔滨：东北林业大学，2013.
	ZHOU X Y.Research on 84K populus regeneration and genetic transformation system［D］.Harbin：Northeast Forestry University，2013.
12	WANG H H， WANG C T， LIU H，et al.An efficient Agrobacterium-mediated transformation and regeneration system for leaf explants of two elite aspen hybrid clones Populus alba×P.berolinensis and Populus davidiana×P.bolleana ［J］.Plant Cell Reports，2011，30（11）：2037-2044.
13	陈仲，廖维华，王静澄，等.影响农杆菌介导的杨树遗传转化技术的因素［J］.植物生理学报，2014，50（8）：1126-1134.
	CHEN Z， LIAO W H， WANG J C，et al.Factors influencing frequency of Agrobacterium-mediated Populus transformation［J］.Plant Physiology Journal，2014，50（8）：1126-1134.
14	李玉生，陈龙，程和禾，等.长期继代培养的转基因苹果外源基因遗传及表达稳定性分析［J］.中国农业大学学报，2020，25（9）：46-54.
	LI Y S， CHEN L， CHEN H H，et al.Genetic and expression stability analysis of exogenous gene in long-termsubcultured transgenic apples（Malus×domestica Borkh.）［J］.Journal of China Agricultural University，2020，25（9）：46-54.
15	FLADUNG M， HOENICKA H， AHUJA MRAJ.Genomic stability and long-term transgene expression in poplar［J］.Transgenic Research，2013，22（6）：1167-1178.
16	张炜林，赵岩秋，卢孟柱.杨树愈伤组织转化体系优化及PtKNLPa遗传转化［J/OL］.分子植物育种，（2022-11-07）［2023-10-23］.
	ZHANG W L， ZHAO Y Q， LU M Z.Optimization of callus transformation system and PtKNLPa genetic transformation in Populus alba×P .glandulosa［J/OL］.Molecular Plant Breeding，（2022-11-07）［2023-10-23］..
17	周思君，杨庆凯.植物转基因技术的实用化标准和策略［J］.东北农业大学学报，2000，31（2）：191-198.
	ZHOU S J， YANG Q K.Practical requirements and development strategies of plant transformation［J］.Journal of Northeast Agricultural University，2000，31（2）：191-198.
18	李际红，邢世岩，焦振，等.窄冠白杨组培快繁与再生体系的建立［J］.中国农学通报，2008，24（7）：60-64.
	LI J H， XING S Y， JIAO Z，et al.Tissue culture and regeneration system from leaves of Populus leucopyramidalis in vitro ［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2008，24（7）：60-64.
19	王栋鑫，彭棣，张爽.农杆菌介导木本植物遗传转化的研究进展［J］.北方园艺，2018（2）：181-185.
	WANG D X， PENG D， ZHANG S.Advances in Agrobacterium-mediated transformation of woody plants［J］.Northern Horticulture，2018（2）：181-185.
20	樊金萍，刘冬颖，张娇花，等.金鱼藤（Asarina procumbens）‘维多利亚瀑布’遗传转化体系建立［J］.东北农业大学学报，2021，52（2）：10-16.
	FAN J P， LIU D Y， ZHANG J H，et al.Establishment of genetic transformation system of Asarina procumbens ‘Victoria Falls’［J］.Journal of Northeast Agricultural University，2021，52（2）：10-16.
21	SHU W B， ZHOU H J， JIANG C.The auxin receptor TIR1 homolog（PagFBL 1） regulates adventitious rooting through interactions with Aux/IAA28 in Populus ［J］.Plant Biotechnology Journal，2019，17（2）：338-349.
22	侯丽丽.杨树生长素响应因子ARF7基因的功能研究［D］.泰安：山东农业大学，2021.
	HOU L L.Study on the function of poplar auxin response factor ARF7 gene［D］.Tai’an：Shandong Agricultural University，2021.
23	CONFALONIERI M， BALESTRAZZI A， BISOFFI S.Genetic transformation of Populus nigra by Agrobacterium tumefaciens ［J］.Plant Cell Reports，1994，13（5）：256-261.
24	DE BLOCK M.Factors influencing the tissue culture and the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of hybrid aspen and poplar clones［J］.Plant Physiology，1990，93（3）：1110-1116.
25	FILLATTI J J， SELLMER J， MCCOWN B，et al. Agrobacterium mediated transformation and regeneration of Populus ［J］.Molecular and General Genetics MGG，1987，206：192-199.
26	范源伟，刘挨枝，王华芳，等.胡杨转基因体系的建立［J］.植物学报，2009，44（6）：728-734.
	FAN W Y， LIU A Z， WANG H F，et al.Transformation of Populus euphratica ［J］.Chinese Bulletin of Botany，2009，44（6）：728-734.
27	周春丽，郭卫东，路梅，等.农杆菌介导佛手遗传转化主要影响因素的研究［J］.热带亚热带植物学报，2006，14（5）：374-381.
	ZHOU C L， GUO W D， LU M，et al.Factors effecting the transformation of Citrus medica L.var.sarcodactlis mediated by Agrobacterium ［J］.Journal of Tropical and Subtropical Botany，2006，14（5）：374-381.
28	田颖川，郑均宝，虞红梅，等.转双抗虫基因杂种741毛白杨的研究（英文）［J］.植物学报，2000，42（3）：263-268.
	TIAN Y C， ZHEN J B， YU H M，et al.Studies of transgenic hybrid Poplar 741 carrying two lnsect-resistant genes［J］.Acta Botanica Sinica，2000，42（3）：263-268.
29	尹建道，孙仲序，王玉祥，等.转抗盐碱基因八里庄杨大田释放试验［J］.东北林业大学学报，2004，32（3）：23-25.
	YIN J D， SUN Z X， WANG Y X，et al.Field test of saline resistant transgenic Populus×xiaozhannica cv.“Balizhuangyang”［J］.Journal of Northeast Forestry University，2004，32（3）：23-25.
30	李义良，苏晓华，张冰玉，等.转vgb基因银腺杂种杨的耐涝性［J］.林业科学，2009，45（7）：26-31.
	LI Y L， SU X H， ZHANG B Y，et al.Waterlogging tolerance of vgb-transgenic poplar［J］.Scientia Silvae Sinicae，2009，45（7）：26-31.

引物名称 Name of primer	引物序列（5′→3′） Primer sequences（5′→3′）
35S-F	ACCTCCTCGGATTCCATTG
GUS-R	CGTTGCTTCCGCCAGTG
BtCry3Aa-F	GGCGTAGTAGGTTTCCCGTTTG
BtCry3Aa-R	ATAGTTGCCGCACTTCCATTTT
BtCry3Aa-qPCR-F	CGTAGTAGGTTTCCCGTTTGGT
BtCry3Aa-qPCR-R	CCCTGGCTATGTGGATTTCGT

继代培养时间 Sub-culture time/d	叶片Leaf		叶柄Petiole		茎段Stem
继代培养时间 Sub-culture time/d	分化率 Differentiation rate/%	增殖倍数 Proliferation times	分化率 Differentiation rate/%	增殖倍数 Proliferation times	分化率 Differentiation rate/%	增殖倍数 Proliferation times
35	100.0	5.93（0.30）b	75.0	1.40（0.26）b	100.0	5.87（0.23）a
45	100.0	8.77（0.50）a	80.0	1.87（0.21）ab	100.0	2.37（0.18）b
55	100.0	6.20（0.50）b	100.0	2.00（0.40）a	100.0	2.07（0.20）b
65	85.7	1.67（0.62）c	100.0	1.83（0.25）ab	100.0	2.10（0.15）b

组号 Test No.	侵染条件 Infection condition/min			抗性芽增殖倍数 Proliferation times of resistant buds	PCR检测转化率 Transformation rate detected by PCR/%	GUS检测转化率 Transformation rate detected by GUS/%
组号 Test No.	OD₆₀₀	侵染时间 infection time/min	共培养时间 Coculture time/d	抗性芽增殖倍数 Proliferation times of resistant buds	PCR检测转化率 Transformation rate detected by PCR/%	GUS检测转化率 Transformation rate detected by GUS/%
1	0.4	10	1	1.33（0.05）b	42.86（8.25）cd	38.10（12.60）abc
2	0.6	20	1	0.60（0.05）d	27.78（2.78）d	23.61（6.05）cde
3	0.8	15	1	0.85（0.10）cd	22.69（6.02）d	7.87（3.96）de
4	0.4	15	2	2.08（0.04）a	86.90（7.24）a	54.23（2.17）a
5	0.6	10	2	1.45（0.14）b	54.60（4.60）bc	51.26（3.77）ab
6	0.8	20	2	0.81（0.10）cd	36.84（4.60）cd	32.08（9.12）bc
7	0.4	20	3	0.96（0.04）c	40.74（9.26）cd	28.24（4.70）cd
8	0.6	15	3	1.46（0.11）b	69.05（10.38）ab	10.32（5.21）de
9	0.8	10	3	1.05（0.12）c	41.07（8.44）cd	4.76（4.76）e