Establishment and Optimization of SSR-PCR Reaction System for Casuarina

doi:10.7525/j.issn.1673-5102.2021.02.019

Abstract

Abstract:

In order to obtain the optimal reaction medium of SSR-PCR from casuarina， 24 somaclonal clones from 4 species including Casuarina equisetifolia， C.junghuhniana， C.glauca and C.cunninghamiana， were selected as experimental materials. L₁₆（4⁵） orthogonal design was used to determine the optimum concentrations of four factors（primer， Mg²⁺， dNTP， Taq polymerase） within four concentration levels in the SSR-PCR reaction system of Casuarina respectively， and visual analysis and analysis of variance were used as evaluation. The results showed as follows： The three factors（primer， Mg²⁺， dNTP） had significant differences on the SSR-PCR reaction systems（P＜0.01） respectively， and the order of significance was primer＞Mg²⁺＞dNTP， while Taq polymerase had no significant difference. The two optimal SSR-PCR reaction systems（10 μL） of Casuarina were determined， including system 6， which consisted of 1×PCR buffer， 2ng template DNA， 0.5 μmol·L^-1 primer， 1.5 mmol·L^-1 Mg²⁺， 0.1mmol·L^-1 dNTP， 0.5 U Taq polymerase， and system 15， which contained 1×PCR buffer， 2 ng template DNA， 0.5 μmol·L^-1 primer， 1.75 mmol·L^-1 Mg²⁺， 0.2 mmol·L^-1 dNTP， 1.25 U Taq polymerase. The system 6 was better than system 15. 60℃ was determined as the optimal annealing temperature of the fluorescent primers M26 and M36.

Key words: SSR-PCR reaction system, orthogonal design, Casuarina

CLC Number:

S792.93

Zhen LI, Chong-Lu ZHONG, Yong ZHANG, Yong-Cheng WEI, Jing-Xiang MENG. Establishment and Optimization of SSR-PCR Reaction System for Casuarina[J]. Bulletin of Botanical Research, 2021, 41(2): 312-320.

Figures/Tables 10

Table 1

Table 2

Fig.1

Fig.2

Table 3

Table 4

Table 5

Table 6

Fig.3

Fig.4

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引物序列 Primer sequence(5′—3′)	引物名称 Name of the primer	5′修饰 5′ modification	纯化方式 Purification
GCCGTCTCTGAGAGTTTTGG	EST-M26（F）	TAM	HPL
TAGAGACTGATCCTCGGCGT	EST-M26（R）	TAM	PAG
CGGAGGAGCTGTTGGTACTC	EST-M36（F）	FAM	HPL
TACTTGCAGGTCGCTTTCCT	EST-M36（R）	FAM	PAG

处理 Treatment	Taq酶 Taq polymerase （U）	Mg²⁺浓度 Concentration of Mg²⁺ (mmol·L^-1)	dNTP浓度 Concentration of dNTP (mmol·L^-1)	引物浓度 Concentration of primer （μmol·L^-1）
1	0.25	1.25	0.10	0.05
2	0.25	1.50	0.20	00.1
3	0.25	1.75	0.30	0.25
4	0.25	2.00	0.40	0.50
5	0.50	1.25	0.20	0.25
6	0.50	1.50	0.10	0.50
7	0.50	1.75	0.40	0.05
8	0.50	2.00	0.30	0.10
9	1.00	1.25	0.30	0.50
10	1.00	1.50	0.40	0.25
11	1.00	1.75	0.10	0.10
12	1.00	2.00	0.20	0.05
13	1.25	1.25	0.40	0.10
14	1.25	1.50	0.30	0.05
15	1.25	1.75	0.20	0.50
16	1.25	2.00	0.10	0.25

结果 Results	Taq酶 Taq polymerase	Mg²⁺	dNTP	引物 Primer
k₁	9.75	7.25	10.08	4.00
k₂	9.83	10.17	10.33	6.25
k₃	9.33	10.08	9.08	12.67
k₄	8.50	9.92	7.92	14.50
R	1.34	2.92	2.42	10.50

变异来源 Source	自由度 df	方差 SS	均方 MS	F值 F value	P值 P value
Taq酶 Taq polymerase	3	13.396	4.465	2.01	0.130 4
Mg²⁺	3	71.229	23.743	10.69	<0.000 1^**
dNTP	3	43.563	14.521	6.54	0.001 3^**
引物primer	3	909.063	303.021	136.44	<0.000 1^**
误差 Error	35	77.729	2.221
校正总和 Corrected Total	47	1 114.979

因素Factor	水平Level
因素Factor	1	2	3	4
Taq酶 Taq polymerase	9.75^a	9.83^a	9.33^a	8.50^a
Mg²⁺	7.25^b	10.17^a	10.08^a	9.92^a
dNTP	10.08^a	10.33^a	9.08^ab	7.92^b
引物Primer	4.00^d	6.25^c	12.67^b	14.50^a