木麻黄SSR-PCR反应体系的建立与优化

doi:10.7525/j.issn.1673-5102.2021.02.019

摘要/Abstract

摘要：

为得到木麻黄SSR-PCR反应的最佳体系，以4个种（短枝木麻黄、山地木麻黄、粗枝木麻黄、细枝木麻黄）的24个无性系为材料，采用L₁₆（4⁵）正交设计对影响木麻黄SSR-PCR反应的4个因素（Taq酶、dNTP、Mg²⁺和引物）在4个水平上进行了优化，并利用直观分析和方差分析两种方法对PCR结果进行评价。结果表明：引物、Mg²⁺和dNTP均对木麻黄SSR-PCR反应结果有极显著的影响（P＜0.01），影响程度由大到小为：引物＞Mg²⁺＞dNTP，而Taq酶对扩增结果无显著影响；确定了两种木麻黄SSR-PCR反应体系（体系6和体系15），体系6为1×PCR buffer、2ng模板DNA、0.5 μmol·L^-1引物、1.5 mmol·L^-1 Mg²⁺、0.1 mmol·L^-1 dNTP、0.5 U Taq酶；体系15为1×PCR buffer、2ng模板DNA、0.5 μmol·L^-1引物、1.75 mmol·L^-1 Mg²⁺、0.2 mmol·L^-1 dNTP、1.25 U Taq酶，反应体系共10 μL，不足部分用ddH₂O补足。从节约成本和降低非特异性产物的角度考虑可将体系6作为最佳体系，体系15为备用体系；本试验所选荧光引物M26、M36的退火温度在52~62℃均可扩增出清晰明亮的条带。为简化操作步骤和减少非特异性产物，可选择60℃作为引物M26、M36的最佳退火温度。

关键词: 木麻黄, SSR-PCR反应体系, 正交设计

Abstract:

In order to obtain the optimal reaction medium of SSR-PCR from casuarina， 24 somaclonal clones from 4 species including Casuarina equisetifolia， C.junghuhniana， C.glauca and C.cunninghamiana， were selected as experimental materials. L₁₆（4⁵） orthogonal design was used to determine the optimum concentrations of four factors（primer， Mg²⁺， dNTP， Taq polymerase） within four concentration levels in the SSR-PCR reaction system of Casuarina respectively， and visual analysis and analysis of variance were used as evaluation. The results showed as follows： The three factors（primer， Mg²⁺， dNTP） had significant differences on the SSR-PCR reaction systems（P＜0.01） respectively， and the order of significance was primer＞Mg²⁺＞dNTP， while Taq polymerase had no significant difference. The two optimal SSR-PCR reaction systems（10 μL） of Casuarina were determined， including system 6， which consisted of 1×PCR buffer， 2ng template DNA， 0.5 μmol·L^-1 primer， 1.5 mmol·L^-1 Mg²⁺， 0.1mmol·L^-1 dNTP， 0.5 U Taq polymerase， and system 15， which contained 1×PCR buffer， 2 ng template DNA， 0.5 μmol·L^-1 primer， 1.75 mmol·L^-1 Mg²⁺， 0.2 mmol·L^-1 dNTP， 1.25 U Taq polymerase. The system 6 was better than system 15. 60℃ was determined as the optimal annealing temperature of the fluorescent primers M26 and M36.

Key words: SSR-PCR reaction system, orthogonal design, Casuarina

中图分类号:

S792.93

李振, 仲崇禄, 张勇, 魏永成, 孟景祥. 木麻黄SSR-PCR反应体系的建立与优化[J]. 植物研究, 2021, 41(2): 312-320.

Zhen LI, Chong-Lu ZHONG, Yong ZHANG, Yong-Cheng WEI, Jing-Xiang MENG. Establishment and Optimization of SSR-PCR Reaction System for Casuarina[J]. Bulletin of Botanical Research, 2021, 41(2): 312-320.

图/表 10

表1

表2

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图2

表3

表4

表5

表6

图3

图4

参考文献 31

1	Midgley S J，Turnbull J W，Johnston R D.Casuarina ecology，management and utilization［M］.Melbourne：CSIRO，1983.
2	张勇，仲崇禄，陈羽，等.海南5年生木麻黄优良无性系的选择与评价［J］.南京林业大学学报：自然科学版，2011，35（5）：25-30.
	Zhang Y，Zhong C L，Chen Y，et al.Evaluation and selection of superior Casuarina clones in Hainan［J］.Journal of Nanjing Forestry University：Natural Science Edition，2011，35（5）：25-30.
3	张勇.三种木麻黄的遗传改良研究［D］.北京：中国林业科学研究院，2013.
	Zhang Y.Studies on genetic improvement of three Casuarina species［D］.Beijing：Chinese Academy of Forestry，2013.
4	仲崇禄，张勇.我国木麻黄的引种培育和经营［J］.林业科技开发，2003，17（2）：3-5.
	Zhong C L，Zhang Y.Introduction，cultivation and management of Casuarina equisetifolia in China［J］.China Forestry Science and Technology，2003，17（2）：3-5.
5	仲崇禄，白嘉雨，张勇.我国木麻黄种质资源引种与保存［J］.林业科学研究，2005，18（3）：345-350.
	Zhong C L，Bai J Y，Zhang Y.Introduction and conservation of Casuarina trees in China［J］.Forest Research，2005，18（3）：345-350.
6	Tautz D，Renz M.Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes［J］.Nucleic Acids Research，1984，12（10）：4127-4138.
7	Tuler A C，Carrijo T T，Nóia L R，et al.SSR markers：a tool for species identification in Psidium（Myrtaceae）［J］.Molecular Biology Reports，2015，42（11）：1501-1513.
8	李树春，夏辉，严冬，等.不同派别杨树无性系SSR遗传距离及聚类分析［J］.植物研究，2015，35（1）：68-76.
	Li S C，Xia H，Yan D，et al.SSR of genetic distance and clustering analysis on different Populus section clones［J］.Bulletin of Botanical Research，2015，35（1）：68-76.
9	袁佳秋，田野，洑香香.基于EST-SSR标记的南方型黑杨主栽无性系鉴定及亲缘关系分析［J］.植物研究，2019，39（5）：770-778.
	Yuan J Q，Tian Y，Fu X X.Genetic identification and relationship analysis of main southern-type poplar clones with EST-SSR［J］.Bulletin of Botanical Research，2019，39（5）：770-778.
10	Huang L K，Huang X，Yan H D，et al.Constructing DNA fingerprinting of Hemarthria cultivars using EST-SSR and SCoT markers［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，2014，61（6）：1047-1055.
11	Chen Y N，Dai X G，Hou J，et al.DNA fingerprinting of oil Camellia cultivars with SSR markers［J］.Tree Genetics & Genomes，2016，12（1）：7.
12	Yagi M，Shirasawa K，Waki T，et al.Construction of an SSR and RAD marker-based genetic linkage map forCarnation （Dianthus caryophyllus L.）［J］.Plant Molecular Biology Reporter，2017，35（1）：110-117.
13	Wang H M，Lin Z X，Zhang X L，et al.Mapping and quantitative trait loci analysis of Verticillium wilt resistance genes in Cotton［J］.Journal of Integrative Plant Biology，2008，50（2）：174-182.
14	Sørensen K K，Kirk H G，Olsson K，et al.A major QTL and an SSR marker associated with glycoalkaloid content in potato tubers from Solanum tuberosum×S.sparsipilum located on chromosome I［J］.Theoretical and Applied Genetics，2008，117（1）：1-9.
15	Kherwar D，Usha K，Mithra S V A，et al.Microsatellite（SSR） marker assisted assessment of population structure and genetic diversity for morpho-physiological traits in guava（Psidium guajava L.）［J］.Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology，2018，27（3）：284-292.
16	Kullan A R K，Kulkarni A V，Kumar R S，et al.Development of microsatellite markers and their use in genetic diversity and population structure analysis in Casuarina［J］.Tree Genetics & Genomes，2016，12（3）：49.
17	Wang M S，Wang W J，Xiao G X，et al.Genetic diversity analysis of spawner and recaptured populations of Chinese shrimp（Fenneropenaeus chinensis） during stock enhancement in the Bohai Bay based on an SSR marker［J］.Acta Oceanologica Sinica，2016，35（8）：51-56.
18	蔡年辉，许玉兰，王亚楠，等.基于SSR标记的不同优势等级云南松遗传多样性分析［J］.植物研究，2019，39（1）：87-95.
	Cai N H，Xu Y L，Wang Y N，et al.Genetic diversity characteristics in different dominance hierarchies of Pinus yunnanensis franch.trees［J］.Bulletin of Botanical Research，2019，39（1）：87-95.
19	周晓丽，杨青，丁晖，等.福建武夷山甜槠不同世代种群遗传多样性的SSR分析［J］.植物研究，2014，34（5）：671-677.
	Zhou X L，Yang Q，Ding H，et al.SSR analysis on genetic diversity of different generations in Castanopsis eyrei from Wuyishan，Fujian Province［J］.Bulletin of Botanical Research，2014，34（5）：671-677.
20	龙萄，黄春琼，刘国道.正交设计优化狗牙根SSR-PCR反应体系［J］.基因组学与应用生物学，2016，35（1）：198-205.
	Long T，Huang C Q，Liu G D.Optimization of SSR-PCR reaction system for Cynodon dactylon by orthogonal design［J］.Genomics and Applied Biology，2016，35（1）：198-205.
21	王芳，廖柏勇，李培，等.苦楝SSR-PCR反应体系优化及引物筛选［J］.林业科学研究，2016，29（2）：167-175.
	Wang F，Liao B Y，Li P，et al.Optimization of SSR-PCR reaction system and primer screening of Melia azedarach［J］.Forest Research，2016，29（2）：167-175.
22	李显煌，高丽云，王娟，等.云南金花茶SSR-PCR反应体系的建立与优化［J］.中南林业科技大学学报，2019，39（8）：101-108.
	Li X H，Gao L Y，Wang J，et al.Establishment and optimization of the SSR-PCR reaction system in Camellia fascicularis H.T.Chang［J］.Journal of Central South University of Forestry & Technology，2019，39（8）：101-108.
23	胡盼，仲崇禄，张勇，等.木麻黄EST序列中SSR的分布特征及有效SSR标记的筛选［J］.植物研究，2016，36（1）：116-122.
	Hu P，Zhong C L，Zhang Y，et al.Distribution and molecular marker of SSR in EST resource ofCasuarinaceae［J］.Bulletin of Botanical Research，2016，36（1）：116-122.
24	许秀玉.木麻黄青枯病的抗性鉴定及EST-SSR关联分析［D］.北京：中国林业科学研究院，2017.
	Xu X Y.Identification of bacterial wilt resistance and EST-SSR association analysis in Casuarinaceae［D］.Beijing：Chinese Academy of Forestry，2017.
25	余微，仲崇禄，张勇，等.短枝木麻黄无性系鉴定及其指纹图谱构建［J］.林业科学研究， 2019，32（5）：157-164.
	Yu W，Zhong C L，Zhang Y，et al.Identification and fingerprinting construction of Casuarinaequisetifolia clones［J］.Forest Research，2019，32（5）：157-164.
26	Doyle J J，Doyle J L，Doyle J J，et al.A rapid DNA isolation procedure for small amounts of fresh leaf tissue［J］.Phytochemical Bulletin，1987，19（1）：11-15.
27	何正文，刘运生，陈立华，等.正交设计直观分析法优化PCR条件［J］.湖南医科大学学报，1998，23（4）：403-404.
	He Z W，Liu Y S，Chen L H，et al.Orthogonal design-direct analysis for PCR optimization［J］.Bulletin of Hunan Medical University，1998，23（4）：403-404.
28	王开芳，燕丽萍，任飞，等.毛梾SSR-PCR反应体系优化及引物筛选［J］.分子植物育种，2019，17（23）：7834-7839.
	Wang K F，Yan L P，Ren F，et al.Optimization and primers screening of SSR-PCR reaction system for Cornus walteri［J］.Molecular Plant Breeding，2019，17（23）：7834-7839.
29	马泽华，刘顺枝，徐社金，等.正交设计优化番石榴属（Psidium）属植物SSR-PCR反应体系和引物筛选［J］.分子植物育种，2019，17（24）：8191-8200.
	Ma Z H，Liu S Z，Xu S J，et al.Optimization for SSR-PCR reaction system of Psidium Trees by orthogonal design method and primers screening［J］.Molecular Plant Breeding，2019，17（24）：8191-8200.
30	王志勇，郭海林，刘建秀.正交设计优化狗牙根SSR-PCR反应体系［J］.分子植物育种，2007，5（S6）：201-206.
	Wang Z Y，Guo H L，Liu J X.Optimization of SSR-PCR system on Cynodon spp. by orthongonal design［J］.Molecular Plant Breeding，2007，5（S6）：201-206.
31	帕提古丽·麦麦提敏，张延辉，李培英，等.狗牙根EST-SSR反应体系优化及其遗传多样性初步分析［J］.新疆农业大学学报，2014，37（2）：112-118.
	Patiguli M M T M，Zhang Y H，Li P Y，et al.Preliminary analysis on optimization of EST-SSR PCR reaction system and genetic diversity for Cynodon dactylon L.［J］.Journal of Xinjiang Agricultural University，2014，37（2）：112-118.

引物序列 Primer sequence(5′—3′)	引物名称 Name of the primer	5′修饰 5′ modification	纯化方式 Purification
GCCGTCTCTGAGAGTTTTGG	EST-M26（F）	TAM	HPL
TAGAGACTGATCCTCGGCGT	EST-M26（R）	TAM	PAG
CGGAGGAGCTGTTGGTACTC	EST-M36（F）	FAM	HPL
TACTTGCAGGTCGCTTTCCT	EST-M36（R）	FAM	PAG

处理 Treatment	Taq酶 Taq polymerase （U）	Mg²⁺浓度 Concentration of Mg²⁺ (mmol·L^-1)	dNTP浓度 Concentration of dNTP (mmol·L^-1)	引物浓度 Concentration of primer （μmol·L^-1）
1	0.25	1.25	0.10	0.05
2	0.25	1.50	0.20	00.1
3	0.25	1.75	0.30	0.25
4	0.25	2.00	0.40	0.50
5	0.50	1.25	0.20	0.25
6	0.50	1.50	0.10	0.50
7	0.50	1.75	0.40	0.05
8	0.50	2.00	0.30	0.10
9	1.00	1.25	0.30	0.50
10	1.00	1.50	0.40	0.25
11	1.00	1.75	0.10	0.10
12	1.00	2.00	0.20	0.05
13	1.25	1.25	0.40	0.10
14	1.25	1.50	0.30	0.05
15	1.25	1.75	0.20	0.50
16	1.25	2.00	0.10	0.25

结果 Results	Taq酶 Taq polymerase	Mg²⁺	dNTP	引物 Primer
k₁	9.75	7.25	10.08	4.00
k₂	9.83	10.17	10.33	6.25
k₃	9.33	10.08	9.08	12.67
k₄	8.50	9.92	7.92	14.50
R	1.34	2.92	2.42	10.50

变异来源 Source	自由度 df	方差 SS	均方 MS	F值 F value	P值 P value
Taq酶 Taq polymerase	3	13.396	4.465	2.01	0.130 4
Mg²⁺	3	71.229	23.743	10.69	<0.000 1^**
dNTP	3	43.563	14.521	6.54	0.001 3^**
引物primer	3	909.063	303.021	136.44	<0.000 1^**
误差 Error	35	77.729	2.221
校正总和 Corrected Total	47	1 114.979

因素Factor	水平Level
因素Factor	1	2	3	4
Taq酶 Taq polymerase	9.75^a	9.83^a	9.33^a	8.50^a
Mg²⁺	7.25^b	10.17^a	10.08^a	9.92^a
dNTP	10.08^a	10.33^a	9.08^ab	7.92^b
引物Primer	4.00^d	6.25^c	12.67^b	14.50^a