基于CRISPR/Cas9的拟南芥CKX3基因编辑载体构建及转化研究

doi:10.7525/j.issn.1673-5102.2021.06.020

植物研究 ›› 2021, Vol. 41 ›› Issue (6): 1015-1022.doi: 10.7525/j.issn.1673-5102.2021.06.020

基于CRISPR/Cas9的拟南芥CKX3基因编辑载体构建及转化研究

王泽琛¹^,², 肖荣², 欧阳乐军¹^,²(), 李莉梅², 梁楚炎², 潘璟茵², 刘智超²

^1.喀什大学生命与地理科学学院，叶尔羌绿洲生态与生物资源研究高校重点实验室，喀什 844000
^2.广东石油化工学院生物与食品工程学院，茂名 525000

收稿日期:2020-07-08 出版日期:2021-11-20 发布日期:2021-10-29
通讯作者: 欧阳乐军 E-mail:ouyanglejun@gdupt.edu.cn
作者简介:王泽琛（1994—），男，硕士研究生，主要从事植物基因工程方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(32071780);广东省自然科学基金项目(2019A1515010709);广东科技计划大专项(mmkj2020035);广东省教育厅重点项目(2018KZDXM047)

Construction and Transformation of Arabidopsis CKX3 Gene Editing Vector Based on CRISPR/Cas9

Ze-Chen WANG¹^,², Rong XIAO², Le-Jun OUYANG¹^,²(), Li-Mei LI², Chu-Yan LIANG², Jing-Yin PAN², Zhi-Chao LIU²

^1.College of Life and Geographic Sciences，The Key Laboratory of Ecology and Biological Resources in Yarkand Oasis at Colleges & Universities under the Department of Education of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Kashi University，Kashi 844000
^2.College of Biological and Food Engineering，Guangdong University of Petrochemical Technology，Maoming 525000

Received:2020-07-08 Online:2021-11-20 Published:2021-10-29
Contact: Le-Jun OUYANG E-mail:ouyanglejun@gdupt.edu.cn
About author:WANG Ze-Chen（1994），male，master degree candidate，plant genetic engineering.
Supported by:
National Natural Science Foundation of China(32071780);Guangdong Natural Science Foundation of China(2019A1515010709);Guangdong Science and Technology Program(mmkj2020035);Guangdong Provincial Department of Education Key Project(2018KZDXM047)

摘要/Abstract

摘要：

细胞分裂素（cytokinin，CK）是参与植物生长发育过程中的关键激素，在植物生长、发育过程起着非常重要作用。细胞分裂素氧化酶/脱氢酶（cytokinin oxidase/dehydrogenase，CKX）是一种不可逆降解细胞分裂素为腺嘌呤/腺苷的黄素酶，作为细胞分裂素信号中降解分支的关键酶，对于维持植物体内的细胞分裂素平衡有着重要作用，有效的控制了植物内源细胞分裂素的水平。选取拟南芥CKX3为目标基因，通过含有拟南芥种皮重组启动子与荧光筛选标记基因mCherry的CRISPR/Cas9载体，来进行高效的拟南芥CKX3基因编辑载体构建并转化拟南芥。利用倒置荧光显微镜筛选具有红色荧光的T₀代种子并种植培养获得T₁代植株。提取T₁代植株基因组进行PCR鉴定和测序分析，鉴定纯合突变后代的性状表型及激素测定。结果表明，本实验成功构建了编辑载体pHEE401E-mCherry-CKX3，拟南芥转化后代中目标基因成功被高效编辑，CKX3的纯合突变植株表型与野生型差异明显，内源激素含量差异达到显著水平。为研究CKX基因功能奠定了基础。

关键词: 细胞分裂素, 氧化酶, 脱氢酶, 基因编辑, mCherry, CRISPR/Cas9

Key words: cytokinin, oxidase, dehydrogenase, gene editing, mCherry, CRISPR/Cas9

中图分类号:

Q789

王泽琛, 肖荣, 欧阳乐军, 李莉梅, 梁楚炎, 潘璟茵, 刘智超. 基于CRISPR/Cas9的拟南芥CKX3基因编辑载体构建及转化研究[J]. 植物研究, 2021, 41(6): 1015-1022.

Ze-Chen WANG, Rong XIAO, Le-Jun OUYANG, Li-Mei LI, Chu-Yan LIANG, Jing-Yin PAN, Zhi-Chao LIU. Construction and Transformation of Arabidopsis CKX3 Gene Editing Vector Based on CRISPR/Cas9[J]. Bulletin of Botanical Research, 2021, 41(6): 1015-1022.

图/表 8

表1

图1

图2

图3

图4

图5

图 6

图7

参考文献 17

1	段娜，贾玉奎，徐军，等.植物内源激素研究进展［J］.中国农学通报，2015，31（2）：159-165.
	Duan N，Jia Y K，Xu J，et al.Research progress on plant endogenous hormones［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2015，31（2）：159-165.
2	Galuszka P，Frébortová J，Werner T，et al.Cytokinin oxidase/dehydrogenase genes in barley and wheat：cloning and heterologous expression［J］.European Journal of Biochemistry，2004，271（20）：3990-4002.
3	Kowalska M，Galuszka P，Frébortová J，et al.Vacuolar and cytosolic cytokinin dehydrogenases of Arabidopsis thaliana：heterologous expression，purification and properties［J］.Phytochemistry，2010，71（17-18）：1970-1978.
4	Laskey J G，Patterson P，Bilyeu K，et al.Rate enhancement of cytokinin oxidase/dehydrogenase using 2，6-dichloroindophenol as an electron acceptor［J］.Plant Growth Regulation，2003，40（3）：189-196.
5	Lei Z ， Zhao Y ， Gao L ， et al.TaCKX6‐D1， the ortholog of rice OsCKX2， is associated with grain weight in hexaploid wheat［J］.New Phytologist， 2012， 195（3）574-584..
6	Gu R L，Fu J J，Guo S，et al.Comparative expression and phylogenetic analysis of maize cytokinin dehydrogenase/oxidase （CKX） gene family［J］.Journal of Plant Growth Regulation，2010，29（4）：428-440.
7	Werner T，Motyka V，Laucou V，et al.Cytokinin-deficient transgenic Arabidopsis plants show multiple developmental alterations indicating opposite functions of cytokinins in the regulation of shoot and root meristem activity［J］.The Plant Cell，2003，15（11）：2532-2550.
8	Hewelt A，Prinsen E，Schell J，et al.Promoter tagging with a promoterless ipt gene leads to cytokinin-induced phenotypic variability in transgenic tobacco plants：implications of gene dosage effects［J］.The Plant Journal，1994，6（6）：879-891.
9	Yang S H，Yu H，Xu Y F，et al.Investigation of cytokinin-deficient phenotypes in Arabidopsis by ectopic expression of orchid DSCKX1［J］.FEBS Letters，2003，555（2）：291-296.
10	Huang S，Cerny R E，Qi Y L，et al.Transgenic studies on the involvement of cytokinin and gibberellin in male development［J］.Plant Physiology，2003，131（3）：1270-1282.
11	欧阳乐军，李莉梅，马铭赛，等.CRISPR/Cas9技术发展及其应用进展［J］.西北农林科技大学学报：自然科学版，2019，47（10）：34-40.
	Ouyang L J，Li L M，Ma M S，et al.Development and application progress ofCRISPR/Cas9technology［J］.Journal of Northwest A&F University：Natural Science Edition，2019，47（10）：34-40.
12	李莉梅，欧阳乐军，尹爱国，等.1种大片段敲除巨桉细胞分裂素氧化酶基因的CRISPR载体构建［J］.江苏农业科学，2018，46（12）：19-22.
	Li L M，Ouyang L J，Yin A G，et al.Construction of eucalyptus genome editing vector by using CRISPR/Cas9 system and knockout Klenow fragment of cytokinin oxidase/dehydrogenase gene［J］.Jiangsu Agricultural Sciences，2018，46（12）：19-22.
13	Gui Z，Liu H Q，Wang Y，et al.Detection of the genetic variation of polygalacturonase -inhibiting protein gene 2 in autotetraploid alfalfa（Medicago sativa） using an improved SSCP technique［J］.Genetics and Molecular Research，2014，13（4）：10184-10193.
14	方凯伦，杨辉.CRISPR/Cas工具的开发和应用［J］.科学通报，2020，65（11）：973-990.
	Fang K L，Yang H.Advances and applications of CRISPR/Cas toolbox［J］.Chinese Science Bulletin，2020，65（11）：973-990.
15	欧阳乐军，袁玉梅，李莉梅，等.巨桉miR156 CRISPR/Cas9载体构建［J］.森林与环境学报，2018，38（4）：488-493.
	Ouyang L J，Yuan Y M，Li L M，et al.Construction of Eucalyptus grandismiR156 family CRISPR/Cas9 vector［J］.Journal of Forest and Environment，2018，38（4）：488-493.
16	欧阳乐军，马铭赛，陈梓洛，等.一种拟南芥基因高效编辑体系研究［J］.植物研究，2019，39（6）：869-875.
	Ouyang L J，Ma M S，Chen X L，et al.An efficient gene editing research system of Arabidopsis［J］.Bulletin of Botanical Research，2019，39（6）：869-875.
17	王宝增，安康.植物顶端优势调控研究概述［J］.生物学教学，2020，45（3）：2-4.
	Wang B Z，An K.An overview of the research on the regulation of plant apical dominance［J］.Biology Teaching，2020，45（3）：2-4.

引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence（5′→3′）	引物用途 Primers use
CKX3-F	ctagagtcgaagtagtgattgTCCACCGTCCGATCACTTGgttttagagctagaaatagc	载体构建 Vector construction
CKX3-R	tgctatttctagctctaaaacCGGGTATAGCGGCAGACATCaatctcttagtcgactcta	载体构建 Vector construction
CKX3-GT1	CTTCGCGGTGTTAGGAGGTT	鉴定引物 Identify primers
CKX3-GT2	TCCACCTCGGACCAAAATGT	鉴定引物 Identify primers

[1]	王泽琛, 刘亚梅, 欧阳乐军, 李莉梅, 梁楚炎, 潘璟茵. 一种带有可视化筛选标记的桉树基因编辑载体构建及验证研究[J]. 植物研究, 2021, 41(5): 816-823.
[2]	彭春雪, 崔雪梅, 沈海龙. 暴马丁香成熟胚愈伤组织和体胚诱导及其生理状态解析[J]. 植物研究, 2021, 41(4): 557-563.
[3]	武国凡, 成宏斌, 吴玉俊, 沈娟, 吴旺泽. CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥BRI1突变体的鉴定[J]. 植物研究, 2021, 41(3): 362-371.
[4]	胡馨丹, 李瑶, 张小花, 梁娟红, 张腾国. 外源ATP对油菜幼苗耐寒性的影响[J]. 植物研究, 2021, 41(2): 302-311.
[5]	欧阳乐军, 马铭赛, 陈梓洛, 黄嘉玲, 布梁灏, 陈自银, 李莉梅. 一种拟南芥基因高效编辑体系研究[J]. 植物研究, 2019, 39(6): 869-875.
[6]	彭春雪, 崔雪梅, 刘春苹, 杨玲, 王秋水, 沈海龙. 3种抗褐化剂影响水曲柳体胚发生的生理分析[J]. 植物研究, 2019, 39(2): 252-258.
[7]	何文平, 王新霞, 张旭强, 杨鹏军, 仇奕之, 杨宁. 低温胁迫下外源脱落酸对高山离子芥抗氧化酶和渗透调节物质的影响[J]. 植物研究, 2016, 36(6): 870-877.
[8]	刘艳菊1,2；曹红星1,2*；张如莲3. 不同时间下低温胁迫对油棕幼苗生理生化变化的影响[J]. 植物研究, 2015, 35(6): 860-865.
[9]	胡文海1*；詹秀花2；闫小红1；王旭明1；黄黎锋3. 24-表油菜素内酯对干旱胁迫下辣椒幼苗叶片抗氧化酶系统及耐旱相关基因表达的影响[J]. 植物研究, 2015, 35(6): 908-914.
[10]	冯汉青；白晶月；管冬冬；贾凌云；孙坤. 胞外H₂O₂及NADPH氧化酶参与了铜胁迫对植物细胞死亡的诱导[J]. 植物研究, 2015, 35(5): 710-715.
[11]	曲丹；王慧梅*；任洁. 碳源对迷迭香悬浮培养细胞的生长、迷迭香酸积累及抗氧化酶活性的影响[J]. 植物研究, 2015, 35(4): 623-627.
[12]	肖政;李纪元*;范正琪;殷恒福. 荔波连蕊茶GA20氧化酶基因的克隆及表达分析[J]. 植物研究, 2014, 34(5): 678-686.
[13]	严俊鑫;关桦楠;迟德富*;张永强;张丹. 机械损伤对重瓣玫瑰防御酶的诱导[J]. 植物研究, 2013, 33(4): 499-503.
[14]	高天鹏;王春燕;徐红伟;孙海丽;张鸣;张庆;石晓妮. 盐生植物盐节木甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及表达[J]. 植物研究, 2013, 33(3): 317-324.
[15]	彭礼琼;金则新*;王强;. 模拟酸雨对濒危物种夏蜡梅幼苗生理生态特性的影响[J]. 植物研究, 2013, 33(2): 202-207.

基于CRISPR/Cas9的拟南芥CKX3基因编辑载体构建及转化研究

Construction and Transformation of Arabidopsis CKX3 Gene Editing Vector Based on CRISPR/Cas9

RichHTML

PDF (PC)

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表 8

参考文献 17

相关文章 15

编辑推荐

Metrics

本文评价