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植物研究 ›› 2008, Vol. 28 ›› Issue (4): 402-407.doi: 10.7525/j.issn.1673-5102.2008.04.005

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利用正交设计优化小苍兰ISSR-PCR反应体系

周凌瑜;吴晨炜;唐东芹;宋会书;刘群录*   

  1. (上海交通大学农业与生物学院园林科学与工程系,上海 200240)
  • 收稿日期:1900-01-01 修回日期:1900-01-01 出版日期:2008-07-20 发布日期:2008-07-20
  • 通讯作者: 刘群录
  • 基金资助:
     

Optimization for ISSR-PCR System of Freesia refracta Klatt Through Orthogonal Design

ZHOU Ling-Yu;WU Chen-Wei;TANG Dong-Qin;SONG Hui-Shu;LIU Qun-Lu*   

  1. (School of Agriculture and Biology,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240)
  • Received:1900-01-01 Revised:1900-01-01 Online:2008-07-20 Published:2008-07-20
  • Contact: LIU Qun-Lu
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摘要: 通过L16(45)正交试验,研究了镁离子浓度、dNTP浓度、模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度这5个因素在4个水平上对ISSR-PCR的影响,建立了适合于小苍兰ISSR-PCR的反应体系。优化体系为:25 μL PCR反应体系中含有1×Taq酶缓冲液(10 mmol·L-1 KCl,8 mmol·L-1(NH4)2SO4,10 mmol·L-1 Tris·HCl,pH 9.0,0.05% NP-40),2 mmol·L-1 MgCl2,0.06 U·μL-1 Taq酶,0.4 μmol·L-1引物,4.0 ng·μL-1模板DNA,dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.6 mmol·L-1。利用温度梯度PCR,确定了最适宜的退火温度为51.5℃。该优化体系的建立为下一步对小苍兰进行ISSR分子标记奠定了基础。

关键词: ISSR-PCR, 小苍兰, 优化, 正交设计

Abstract:

The effects of various factors on ISSR-PCR reaction, such as concentration of Mg2+, dNTPs and primers, DNA template and Taq DNA polymerase, were investigated to optimize the ISSR-PCR reaction system of Freesia refracta through orthogonal tests. The optimized ISSR-PCR system of F. refracta incloded 1×Taq DNA polymerase buffer (10 mmol·L-1 KCl, 8 mmol·L-1(NH4)2SO4, 10 mmol·L-1 Tris·HCl, pH 9.0, 0.05% NP-40), 2 mmol·L-1 MgCl2, 0.06 U·μL-1 Taq DNA polymerase, 0.4 μmol·L-1 primer, 4.0 ng·μL-1 DNA template, 0.6 mmol·L-1 dNTPs in 25 μL PCR reaction system. By temperature gradient PCR, the optimum annealing temperature was determined as 51.5℃. The optimized system laid the groundwork for ISSR molecular analysis of F. refracta.

Key words: ISSR-PCR, Freesia refracta Klatt, optimization, orthogonal design

中图分类号: